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當前位置:首頁 > 文章資訊 > 農(nóng)林牧漁 > 豬場檢疫非洲豬瘟PCR熒光定量樣品采集的嚴格要求
豬場檢疫非洲豬瘟PCR熒光定量樣品采集的嚴格要求
一個完整的非洲豬瘟病原熒光定量PCR檢測流程一般包括:樣品采集及保存;樣品前處理;核酸提取與配液;上機擴增;檢測結(jié)果導出及分析等。
從實驗流程來看
樣本的正確采集及運輸是保證實驗室檢測結(jié)果的首要因素。
采集什么樣品?多少數(shù)量合適?怎么規(guī)范采集?采集后該怎么處理?如果不進行及時檢測,又該怎么保存樣品?檢測完的樣本又該怎么處理?
以檢測非洲豬瘟病毒為例,參考FAO《非洲豬瘟-發(fā)現(xiàn)與診斷》中文版如進行非洲豬瘟病毒檢測,病原學樣品包括:
1. 抗凝血(全血):
采集:使用含有抗凝劑(EDTA-紫色蓋)的無菌管(真空采血管)從頸靜脈、下腔靜脈或耳緣靜脈抽取全血5ml。如果動物已經(jīng)死亡,可以從心臟中采血,但必須立即進行。冷藏運輸,到達檢測實驗室后,可選擇-70℃冷凍保存。
注意:不能使用肝素(綠色蓋子)的無菌采血管,會抑制PCR反應,易造成假陰性。
2. 血清:
采集:使用未加抗凝劑的真空采血管從頸靜脈、下腔靜脈、耳緣靜脈,或剖檢過程收集5ml血液樣品,建議先在4℃放置14-18小時分離血凝塊,丟棄凝固物,并離心10-15分鐘,回收澄清的上清液(血清),血清樣品在分離后可以立即開展檢測,也可冷藏運輸,到達實驗室后,可選擇-70℃冷凍保存。
注意:如血清是紅色,已經(jīng)發(fā)生溶血,不能用于ELISA檢測。
3. 器官和組織樣品
采集:目標器官是脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟等,其中脾臟和淋巴結(jié)通常病毒含量最高,冷藏運輸,盡快提交給實驗室,如無法及時送檢,可將樣品儲存在冷庫或液氮中。可用10%緩沖福爾馬林浸泡30分鐘以上進行病毒的滅活之后再進行PCR的檢測。
注意:如豬場發(fā)現(xiàn)疑似非洲豬瘟癥狀,為避免污染場內(nèi)環(huán)境和人員,請勿在豬場內(nèi)剖檢,盡量求助實驗室,根據(jù)相關(guān)實驗數(shù)據(jù)表明,病死豬每克組織中含PLD50病毒含量達10萬以上。
4. 軟蜱
采集:收集軟蜱,盡量讓蜱存活以確保蜱內(nèi)病毒的保存完好,并避免DNA降解。可將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶/管中,放入少量土壤,蓋內(nèi)襯以紗布,常溫保存運輸。到達檢測實驗室后,-70℃ 冷凍保存或置于液氮中;如僅對樣品進行形態(tài)學觀察,可以放入100%酒精中保存。
注意:其余如蚊蠅等昆蟲同樣如此,盡量使其存活送檢,或者直接儲存在液氮中。
5. 環(huán)境樣品
采集:可多采集環(huán)境拭子,如糞便,泔水,飼料等,4℃保存。
6、唾液樣品
除上訴非洲豬瘟疫情應急實施方案(2019年版)中提到的相關(guān)病原學樣品外,根據(jù)非洲豬瘟的同居感染實驗結(jié)果顯示,非洲豬瘟自然感染情況下病毒最早出現(xiàn)在唾液中,因此建議在無癥狀豬群定期排查時使用唾液作為檢測對象。
采集:采集唾液前盡量對豬群實行停料不停水,可選擇控食過夜,在第二天進食前采集唾液,保證唾液里面沒有食物殘渣,確保唾液樣本質(zhì)量不會影響檢測結(jié)果,同時采集到的唾液如果1小時內(nèi)不能做核酸提取就需要馬上冷凍。
為了獲得正確的診斷,必須在適當?shù)臏囟认?,以最快的速度正確采集樣品,仔細進行包裝保存、做好標記,盡快到達檢測實驗室,運輸?shù)臉悠繁仨氂凶銐驍?shù)量的冷卻材料,例如冰袋,以防止變質(zhì)。
實驗室工作是特別需要樣本支撐的!如果樣品狀況不佳,后續(xù)工作可以不用開展,因為無法做出準確的診斷。
筆者言:對于高效、科研機構(gòu)、動檢動監(jiān)、屠宰企業(yè)、集團化企業(yè),有專業(yè)的實驗室、專業(yè)的人員、專業(yè)的素質(zhì)用PCR做檢測是最科學準確的。PCR設備并不適合現(xiàn)場使用,主要是環(huán)境中可能會存在的污染,非常容易導致“假陽性”,給診斷帶來不必要的誤導。
對于家庭農(nóng)場和中小豬場而言,針對正在發(fā)病的豬和剛剛死亡的豬,使用非洲豬瘟抗原免疫層析快件卡是一個合適的選擇,病毒載量大診斷率更高更合理。
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